Tokyo, Japan
Industrial Plant
進入遊戲，本關類似于一般遊戲的教學關卡，開始會給玩家一些必要的操作提示。根據初始的操作提示消滅第一波敵人,之後會降下一塊踏板使玩家可以繼續前進,在緊閉的門前再次遇到敵人，運用身邊的道具作爲武器來投擲他們，全滅雜兵後大門打開。穿過大門，在道路盡頭發現另一群雜兵。
繼續前進來到控制台前，玩家需要控制自己的人物踏上一邊的踏板，隊友會自動上到另一邊的踏板。由此先後打開兩條通路，一條通向DNA，另一條可以讓玩家繼續遊戲。之後玩家會遇到兩個體型巨大的對手，遊戲會提示使用旁邊寫有“危險”字樣的紅色箱子投擲它們。消滅他們之後，出現一群雜兵，全滅後前進的大門開啓。
系統在這時會提示玩家如何去切換角色，消滅敵人後會降下通向DNA的踏板，在踏板附近出現3個之前遇到的大型敵人，用蜘蛛俠的蜘蛛絲把他們拉倒在地同時進行攻擊，之後站在踏板上激活另一條通路。來到環狀平台處，平台的右方是控制台，站在上面激活升降機（穿過中央的洞），跳上去得到第3個DNA，之後通過通道准備迎接第一場BOSS 戰。
遊戲的第一個BOSS並不是很強，玩家會在之後的機關多次遇到它，它的主要技能是放出波浪狀激光以及一些飛行的機器人，玩家可以在躲避波浪的同時用周圍的箱子來攻擊BOSS，或者抓住這些機器人來攻擊它。BOSS戰敗後大門打開，遇到一批雜兵，打敗他們後直接向前走拿到秘密區域鑰匙。消滅這個區域的敵人後會解開一塊對戰場地。脫出後走上斜坡，在進入屋子前拿到兩過道中央的DNA，全滅屋中敵人後本關結束，之後出現過場動畫。
回到最初的地方，Black Cat成爲可選擇人物。
Secret Lab
進入本關後，眼前就有一個DNA免費到手，不過拿到前，會有一堆雜兵出現，不廢話了，繼續使用蜘蛛絲招呼他們。前進後在一間燈光很亮屋子裏發生另一場雜兵戰，結束後不要忘了在離開之前破壞大門左側的正方形物體得到第2個DNA，之後在下一個屋中的圓柱體頂端找到最後一個DNA。並前進到最後一個房間找到 Dr. Octopus引發Boss戰。
在Dr. Octopus身前有2個發電機，用滑行在軌道上的箱子去破壞，每3次攻擊發電機後Dr. Octopus會下來修理它們，不過在這之前，先要防止自己手中用作攻擊的箱子被激光破壞，同時這些激光還會攻擊蜘蛛俠本人，不過它們對角色的傷害幾乎可以忽略不計，在Dr. Octopus跳到地上修理發電機的時候就是玩家修理它的時候了，一般第一次過去攻擊會被Dr. Octopus用手臂彈開，站起來後繼續攻擊它，直到他修理好發電機重新回到位置上，依照之前的流程反複攻擊Dr. Octopus，直到他的生命值降爲0，之後Dr. Octopus加入隊伍。
The Rooftops
向左走沿階梯向下，之後在房頂上遇到幾個大型雜兵，消滅他們之後跳到另一個相鄰的房頂上，在斜坡底部得到密道鑰匙。然後反方向向上走，跳到另一個更高的房頂得到DNA。打敗另一群雜兵並開啓一扇門。經過兩場戰鬥後玩家可以看到遠處有一扇緊閉的門並同時顯示一個不知道用途的裝置。這時玩家需要跳上屏幕上方的屋頂，並通過金屬箱子跳躍到屋頂的上面。向左走用之前得到的鑰匙打開密道，消滅裏面的敵人後解開另一塊對戰場地。脫出後繼續向右前進得到一個DNA，之後到達剛才所說的裝置那裏，遊戲會提示這時一個産生雜兵的裝置，破壞它的話雜兵就不會出現了。用跳動攻擊可以使玩家避開雜兵的騷擾專心于破壞機器，至于那些雜兵就交給你的隊友對付吧。
穿過大門，接連發生兩場雜兵戰，全滅敵人後站到地板按鈕的上方，按下去以後會激活一座橋通向另一個DNA。拿到DNA後跳到台階上，雜兵出現。再次前進到達以藍色氣球爲背景的屋頂，然後在斜坡底部的右下角角落裏，發現本關隱藏的DNA。之後遇到第一關遇到的那個BOSS，用與之前同樣的方法解決它。解決後穿過大門站在屋子中央的開門按鈕上，本關結束。
Oscorp Japan
先解決幾個雜兵，之後大門打開繼續雜兵戰，消滅他們然後沿樓梯向上，期間進行一場戰鬥，之後再次遇到之前的boss。解決後跳上左側的平台上得到DNA，並消滅一些雜兵。進入大門，穿越上方的岔道之後向左走，你會發現一個隱藏的DNA。然後站在地板的按鈕上打開大門去迎戰本關的最終BOSS。
本關的BOSS是Green Goblin，他會站在遠處向你發射跟蹤導彈和一種黃色球體，該種球體隔一段時間就會爆炸給玩家造成傷害。此戰及其簡單，抓住還未爆炸的黃色球體跳起向 BOSS投擲即可，至于跟蹤導彈也可以連續跳躍來混淆它的攻擊方向，最終Green Goblin戰敗加入隊伍。
Tangaroa Island
Beachside
初始系統會提示玩家如何轉換蜘蛛俠的攻擊方式，按照提示發出蜘蛛絲攻擊敵人，在本關裏，石頭代替了之前關卡小箱子作爲主要的投擲道具。穿過山洞在屏幕上方得到第一個DNA，之後在海灘上擊敗雜兵來打開竹門，穿過竹門再次遇到以前多次出現過的小BOSS，只不過變成了綠色，增加了盾牌和一個棒子，而且發射波浪的頻率變快，可以說實力有所增強。不過玩家站在周圍的大石頭上躲避波浪，然後使用發射蜘蛛絲的技能既可以輕松搞定他了。
穿過大門進行一場雜兵戰，消滅他們後在斷橋上空得到DNA。在門的另一側消滅2個敵人再次打開大門，之後又是無休止的雜兵，幹掉他們激活一座升降台，爬上去通過第一座大橋，這時向屏幕上方可以看到一塊綠色石頭，跳到上面得到DNA，之後又是本關之前的那個小BOSS，沿用之前的方法消滅他。
之後的那座橋需要打倒從頭頂上方跳下的雜兵才能通過，一直向屏幕右方走找到密道鑰匙，然後沿路返回沿階梯向上爬在下一個壁架找到秘密入口，消滅敵人得到另一個對戰場地。之後不斷向上爬，消滅最上面的雜兵生成器，本關通過。
Sea Caves
打倒最初的兩個敵人激活橋對面的升降台，沿平台向上跳迎來下一場戰鬥，之後站在按鈕上連接橋梁，穿過橋跳到另一個壁架上繼續雜兵戰，接著又是按鈕，過橋以後在屏幕上方的平台上得到本關第一個DNA，回到前進的路上會遇到迄今雜兵最多的戰鬥，反正來多少就消滅多少，直到大門爲你敞開。
洞穴裏的第一個敵人又是小boss，消滅後前進遇到一扇門緊閉，需要雙人開啓，進入後得到另一個DNA，之後出大門向右走再次面對源源不斷的敵人，消滅他們後穿過兩扇門對抗本關的最終BOSS————Scorpion。
Scorpion初始站在最高的平台，玩家則站在下面，他會從尾部放出跟蹤彈，並不斷掉落石塊攻擊玩家，近身後Scorpion則是用尾巴攻擊，但是傷害不大，完全可以無視，總之跳到他身邊近身肉搏即可，打敗他Scorpion加入隊伍。
The Cliffs
沿岩石斜坡上行到達綠色區域引發第一場戰鬥。消滅敵人連接左面的橋。然後站在綠色區域的雙人開關上，屏幕上方會出現一座橋引導你去得到第一個DNA。之後回到主線上連續通過兩座橋並引發兩場戰鬥。
跳到階梯上，沿斜坡戰鬥一路向下打開大門，打掉幾個飛行物然後繼續前行。脫出黑暗區域後轉向另一個區域的隧道。不過在這之前先要解決門前面的敵人。向隧道深處走去觸發另一場戰鬥，清理幹淨這些雜兵後大門打開，進入之前先要毀壞左側的石塊來得到裏面的DNA。
在下一個區域，經過圓柱體跳到左邊平台上，接下來的一個平台會有兩個地上按鈕，可以提升水下升降機，運用這個這些升降機一直向左取得秘密區域的鑰匙。回到原路上打敗雜兵開啓秘密區域。脫出後跳到升降台上向上攀爬，到達大平台後一直向左邊的岔路走得到本關第3個DNA。回到門前清楚雜兵並按下門前的開關。
穿過大門，向左跳到懸崖邊上得到本關最後一個DNA。打敗所有的敵人並破壞最終的雜兵生成器，之後站在按鈕上連接大橋過場動畫後，Iron Fist 可使用。
Ancient Ruins
向左走穿過一座橋，在跳到壁架上之前打敗兩夥雜兵，之後啓動地上按鈕連接大橋。穿過兩座橋到達平台上，有一群敵人守著右側一道緊閉著的門，消滅他們進入大門緊接著又是一場戰鬥。解決後一直向左沿小徑取得DNA。這裏有兩個按鈕可以激活通向小徑的橋，之後原路返回按下按鈕之後可以繼續前進。
跨越兩座橋之後，繞過懸崖有一個隱藏按鈕可以升起升降台，讓你可以爬得更高得到高台上的DNA,打敗兩組敵人後到達最終門前准備迎接Boss戰。
迄今爲止最強的Boss，場地很小，很容易就掉下去了。全部場地都環繞著電流，Rhino會重擊地面使岩石掉下同時它還會發射電流來攻擊。用岩石攻擊他，伺機近身進攻（從背面），並不斷移動和跳躍，之後此人加入。
Egypt
Sun-Drenched City
沿樓梯向下，直到啓動地板上的按鈕連接大橋，穿過橋，一場雜兵戰。消滅他們後左方有個按鈕，站上面再次激活橋，過橋後是個巨型機器人，扔炸彈，用拌索輕松解決，離開前破壞左側的箱子得到DNA，下一個區域有個秘密入口，不過沒鑰匙，只好繼續前進。
走到盡頭，又是一場雜兵戰，用飛行的機器人作爲武器砸向巨型的機器人，不過爲了避免被定時炸彈炸到，隨時跳躍還是有必要的。在下一個區域繼續遇到巨型機器人，打法不多說了。進入新開的門，沿樓梯向下，遇到一夥雜兵，問題不大，在過道的盡頭按下按鈕，橋上得到DNA。
沿樓梯向下有一個大空地，發生雜兵戰。門打開後是連續的建築，、發生雜兵戰，之後按下按鈕，使你的隊伍脫出這個城鎮，穿過橋出現雜兵生成器，之後雜兵戰，兩人啓動裝置使得平台移開讓你能到達附近的房頂，上面有DNA和秘密場所的鑰匙，玩家可以回去解開那個秘密區域。
The Oasis
打敗最初的幾個敵人，之後站到按鈕上激活橋，過橋後擊敗幾個雜兵，打開一扇門，在附近密室中得到第一個DNA，之後又是一夥敵人，清理後激活下一座橋。
跳到一塊高地上，過橋，站在雙人裝置上開密室得到密道鑰匙。戰鬥之後站到圓柱旁邊的按鈕上，碰到扔炸彈的雜兵，保持移動，不要站在一個地方過多時間，多運用蜘蛛俠的特技攻擊他們，消滅他們後，平台升起跳上去消滅另一夥敵人後開啓下一個裝置。
這個區域裏橋會連續出現敵人，解決後後激活橋，一直向右走，完成密道任務，之後回來向上走繼續遊戲，進門後巨型機器人戰，過橋穿過過一山洞，打敗這裏的敵人後，繼續前進。。
啓動裝置進入密室得到最後一個DNA，之後一場戰鬥Lizard加入隊伍。
Unearthed Catacombs
雜兵戰，這次的敵人不投擲炸彈了，而是不斷放出攻擊氣流，打敗他們開啓大門，進入之前先進入這間屋子左邊的密室，裏面得到DNA，回到主線，雜病戰後，前進最終是巨怪戰，使用無敵打敗他，開門。
接著兩場戰鬥，下了斜坡又是一場戰鬥，解決後這時沿斜坡回頭向上，會發現另一個秘密房間的門，用蜘蛛絲彈攻擊門兩側的裝置，裏面有密道鑰匙，之後進入右方的房間戰鬥之後發現密道，打敗裏面的敵人得到新的對戰場地。
下一個場景有與斜道上相同的裝置，打破他們之後可以通過，得到一個DNA。過橋後橋雜兵戰，打敗他們以及一個巨型怪物之後找到最後一個DNA，在最後一個房間解決4個敵人本關結束。
Excavation Site
跳下來之後兩場雜兵戰，之後平台升起連接前面的橋，在升起平台的另一側有一個密室進入後得到第一個DNA。之後出現兩個普通的Boss，先用無敵和能量上升解決一個，在用束縛術控制住另外一個，之後近身攻擊。
緊接著又是一場戰鬥，打解決敵人打開另一個房間，不過在進入之前先進入右方的密室得到第二個DNA。回到主線，在另一個區域雜兵戰，解決後升起平台，之後站上平台不斷解決敵人直到最終boss。
這個Boss共有3種攻擊模式，沙子波浪，沙子拳，和沙子穿刺，總之他總是試圖和你保持距離攻擊你，不要向從側面避開他的攻擊，因爲在側面牆壁衝中會出現拳頭攻擊你。總之在遠處使用蜘蛛絲彈射，近了使用格鬥技即可，難度不大，之後Sandman加入隊伍。
Oldworld village
消滅初始的兩個敵人，之後按下按鈕激活大橋。之後闖過兩道雜兵把守的大門，打敗這裏的敵人後，在屏幕右下角的低窪處找到密道鑰匙。到下一個區域不要先上橋，而是向屏幕左上方移動找到開門裝置進入秘密通道，解開新對戰區域後就可以過橋了。
過了橋雜兵戰，之後爬上階梯，進入門之前在門左側找到隱藏的DNA並消滅這裏的3個敵人。 穿過門清理小兵，在屏幕下方的低窪處拿到DNA後脫出，過橋，之後沿階梯上爬在右側發現密室得到DNA，爬到階梯頂上打敗敵人開啓下一個門，之後一路殺敵前進即可。
The Manor House
消滅敵人打開最初的大門，之後消滅雜兵生成器進入屋子，雜兵戰後，啓動右側裝置打開密室得到第一個DNA，之後的向左走繼續進行遊戲，在走道打開右側的門得到密道鑰匙，兩場戰鬥後來到樓梯處，在中間岔道向右走找到隱藏大廳並前往密道。
回到樓梯繼續前進，下一個戰鬥場地被敵人包圍，剿滅所有人後在右側密室得到本關最後一個DNA，之後一路清敵前進，最終本關通關後，Daywalker Blade加入。
Graveyard Path
沿小路下行之後第一場戰鬥。打敗雜兵開大門，沿階梯前進一隊大型敵人，打敗他們可以連接斷橋。過橋破壞雜兵生成器，穿過大門過橋後，向左進入房間得到密道鑰匙。回到正路打敗幾個敵人跳到階梯上去向右走，上面有個DNA，穿過新打開的門。
在水池裏擊敗所有的敵人。穿過下一道門打開密道擊敗裏面的敵人打開另一個對戰區域，脫出密室，破壞門旁邊的石頭得到本關第一個DNA。現在向屏幕右方穿過橋之後連續兩場戰鬥，穿越這其中的第3到門後，上到右側的橋。、走到盡頭有兩塊石頭，右側的裏面有DNA，沿橋走回來來到噴水池前，之後打敗幾個巨型敵人本關結束。
Ancient Church
在教堂的第2個房間和雜兵戰鬥，之後進入下一個房間，上樓梯向左，開門的得到第一個DNA。從右邊的門繼續前進，一場戰鬥之後站在按鈕上打開左側的門，不過這門裏啥也沒有，下一個房間有幹掉幾個雜兵後上到一個螺旋的樓梯。之後在過道左側的密室得到DNA。之後一路前進迎來boss戰。
很簡單的戰鬥，先後有3間屋子，分別放有1，2，3個鈴鐺，首先清理鈴鐺上的束縛物後讓幾個鈴鐺同時響起即可，至于boss的攻擊，可以無視，之後Venom加入隊伍。
Nepal
Lower Village
穿過橋打響第一場戰鬥，解決之後穿過橋繼續遊戲，村落門口是一群雜兵防守，輕松全滅。進入村莊後過橋得到密道鑰匙，再從橋上走回密室解開對戰區域。
繼續前進，在屏幕下方的階梯上得到DNA。向前走找到雜兵生成器毀壞它，之後來到下一道門前，大敗這裏的敵人後先不要著急前進，因爲在這之前要先爬到大門右上方的平台上的密室，並取得其中的DNA，之後戰鬥後開門又是巨型敵人，這次的敵人有盾牌，繞到身後沿用之前方法解決。
打倒幾個雜兵後，打開右側的門得到DNA，再一場雜兵戰後，本關結束。
Dark Caverns
在本關第2道門前的左側把角找到密道鑰匙，持續戰鬥直到遇到巨型敵人。繼續前進找到純金色的雕像進入密道揭開對戰場所，同時這個區域的出口也有個DNA，最後一個DNA在最後一個房間的門口，走到最後過場動畫本關完結。
Upper Village
向前走到房子處，穿過橋進行一場戰鬥之後激活一座橋，過橋戰鬥。在瀑布門口右側房頂的到密室鑰匙進入洞穴，打敗3個大型的敵人可以繼續向上，最頂上是密道，打開秘密對戰場地。
之後遭遇雜兵生成器，在生成器下方的低窪處得到一個DNA，繞過彎道時又是一個DNA，之後則是漫長的戰鬥，最後在寺廟大門的岔路口（也就是本關第2次出現巨型敵人的地方）看到最後一個DNA，之後本關結束。
Temple
先與兩個巨型敵人交戰，解決後進入寺廟，過了第一個屋子在過道的岔路得到本關第1個DNA，之後連續通過3個房間，並在第2，3個房間的側面找到遊戲的最後兩個DNA，之後上樓梯迎來最終boss。
到了最後一關，boss再強也不是你的對手了，本關boss的主要進攻方式是光彈攻擊以及光線掃射，跳躍躲避，之後撿起地上的箱子攻擊他，每3次他會從高台下來與你近身周旋，使用個power up衝過去扁他吧，如此反複幾次之後，幹掉最終boss，全遊戲結束。
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